AISLAMIENTO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA) GENÓMICO Y PLASMÍDICO

Transcripción

1 AISLAMIENTO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA) GENÓMICO Y PLASMÍDICO E l estudio del genoma de los seres vivos a sido uno d los principales objetivos de la Biología. Desde los trabajos de Mendel (1866), pasando por Avery, MacLeod y MacCarty (1944) que demostraron la transformación genética en bacterias, Hersey y Chase (1952) quienes establecen que el DNA y no las proteínas forman el material genético, Watson y Crick (1953) que propusieron el modelo molecular del DNA, Holley y colaboradores, Spiegelman, y Sanger que deducen en sus diversos grupos de investigación las secuencias de RNAs; hasta el uso de las enzimas de restricción y el avance tecnológico de las dos últimas décadas del siglo XX, han permitido conocer la estructura, las características fisicoquímicas, la secuencia, la duplicación y la transcripción del ácido desoxirribonucleico. Este polímero biológico cuando requiere ser estudiando a nivel molecular es necesario aislarlo del sistema celular. Para ello existen diferentes protocolos de purificación y concentración. Uno de los más comunes es aquel en que se emplean soluciones acuosas y detergentes que rompen tanto membrana como pared celular, se inhibe la actividad de las nucleasas, se precipitan proteínas por competitividad con solventes orgánicos y la precipitación y concentración del DNA. OBJETIVO DIDÁCTICO Aprender el procedimiento de aislamiento de ácido desoxirribonucleico genómico y plasmídico basado en las características fisicoquímicas del polímero biológico. OBJETIVO EXPERIMENTAL Realizar el aislamiento de DNA cromosomal de chicharros Y DNA plasmídico de Escherichia coli.

2 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA) DE ORIGEN VEGETAL Material 1 tubo de ensaye 2 vaso de precipitado de 50 ml 2 pipeta graduada de 10 ml 4 pipeta graduadas de 5.0 ml 1 pipeta Pasteur 2 probetas graduadas de 50 ml 2 vasos de precipitados de 50 ml 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml 4 tubos graduados de centrífuga d 15 ml 1 vidrio de reloj 1 cristalizador 1 mortero 1 baño María 1 embudo Buchner 1 gradilla 1 termómetro 1 agitador de vidrio 1 balanza granataria 1 balanza analítica 1 balanza de dos platillos 1 centrífuga clínica 1 parrilla de calentamiento Reactivos 30 ml solución de sacarosa 0.5M-cloruro de calcio M 4.0 ml solución de cloruro de sodio 0.15M-EDTA 0.1M, ph ml solución saturada de cloruro de sodio 20 ml de mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico 24:1 (v/v) 50 ml de alcohol etílico de 96 Agua destilada en piceta 1 filtro de 4 capas de gasa Hielo 15 g de chícharos Aparato

3 PROCEDIMIENTO 1. Se pesan 15 gr de chicharros y se maceran en el mortero hasta formar una papilla. 2. Se coloca el mortero con la papilla en un baño de hielo y se agregan 30 ml. de la solución de sacarosa-cloruro de calcio para continuar el macerado durante un minuto hasta formar un homogeneizado del tejido. 3. Se filtra el homogeneizado a través del filtro de gasa, el filtrado se recibe en un matraz Erlenmeyer que debe estar en baño de hielo. 4. El filtrado se reparte en dos tubos de centrífuga que también deben de encontrase en un baño de hielo. 5. El filtrado se centrifuga a 1,000 r.p.m. durante cinco minutos. 6. Se desecha el sobrenadante y cada pastilla se resuspende en 4.0 ml de solución salina EDTA. 7. Se transfiere la suspensión al vaso de precipitado y se agregan gota a gota 1.5 ml de la solución de SDS recalentado a 60 C. 8. Esta mezcla se incuba en baño María a 60 C durante diez minutos. 9. Posteriormente se deja enfriar a temperatura ambiente y se le adicionan 4.0 ml de solución salina saturada. 10. Se mezcla la reacción y se transfiere a un embudo de separación para que se añada un volumen igual al del contenido de embudo de la mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico. 11. Se agita vigorosamente la mezcla durante quince minutos hasta formar una emulsión. 12. Ésta se transfiere a tubos de centrífuga y se centrifuga a 3,000 r.p.m. durante diez minutos. Si después de este proceso el sobrenadante quedase turbio, es necesario volver a realizar la centrifugación en un intervalo de tiempo similar al anterior. 13. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, se retira cuidadosamente la fase superior del sobrenadante, evitando que se contamine la muestra con la interfase. 14. La fase colectada se pasa a un vaso de precipitado y se añaden lentamente el mismo volumen de alcohol etílico frío. 15. Se agita suavemente el contenido del vaso con la ayuda de un agitador de vidrio en forma circular en un solo sentido para que las fibras de DNA se adhieran a la varilla. 16. Se elimina el exceso del alcohol presionando las fibras contra la pared del vaso. 17. Se transfieren las fibras a un tubo de ensaye que contenga 10 ml de agua destilada. Se agita vigorosamente el contenido el vaso para disolver el DNA. De esta muestra se transfiere a un tubo de ensaye una alícuota de 10 ul y se le agregan 990 ul de amortiguador TE. 18. A esta dilución se le determina la densidad óptica en un espectrofotómetro a 260, 280 y 320 nm, empleando como blanco de referencia al amortiguador TE.

4 AISLAMIENTO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA) DE Escherichia coli Material 2 pipetas graduadas de 5.0 ml estériles 1 asa de siembra 10 tubos Eppendorf 1 gradilla para tubos Eppendorf 7 pipetas graduadas de 1.0 ml (1:100) 1 cristalizador 1 gradilla para tubo de ensaye 1 tubo de ensaye de 13 x 100 mm 1 tapón de algodón-gasa para tubo de cultivo 13 x 100 mm Hielo finamente picado 1 toalla de papel absorbente Reactivos 5.0 ml de caldo de cultivo Luria 1.0 ml de solución I fría 1.0 ml de solución II recientemente preparada 2.0 ml de solución III fría 2.0 ml de mezcla Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1 v/v) 5.0 ml de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1 v/v) 5.0 ml de etanol al 70% 5.0 ml de etanol frío (-20 C) 1 placa con cepa de Escherichia coli XL1-Blue Aparatos 1 campana de flujo laminar (se puede sustituir por dos mecheros bunsen) 1 incubadora con agitación orbital y temperatura regulada 1 microcentrífuga con temperatura regulada 1 agitador mecánico con placa para tubo Eppendorf 1refrigerador con temperatura de -20 C

5 PROCEDIMIENTO 1. Bajo condiciones estériles se sirven 5.0 ml de caldo de cultivo Luria. Con un asa de siembra se toma una colonia bacteriana de la placa de siembra y se transfiere al caldo de cultivo. 2. A este inoculo se le adiciona ml del antibiótico y se incuba a 37 centígrados durante 18 horas. 3. A un tubo Eppendorf se pasan 1.5 ml del cultivo y se centrifugan a 5,000 r.p.m. durante un minuto. 4. Se aspira el sobrenadante para dejar la pastilla tan seca como sea posible. La pastilla se resuspende en 0.1 ml de la solución I fría y se deja reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos. 5. Se adiciona a la suspensión 0.2 ml de la solución II recientemente preparada y se deja reposar en baño de hielo por cinco minutos. Transcurrido el tiempo, se añade 0.15 ml de la solución III fría. 6. La mezcla se agita suavemente en un agitador mecánico en posición invertida durante diez minutos y después se reposa en baño de hielo por periodo de cinco minutos. 7. Posteriormente, se centrifuga la muestra a 10,000 r.p.m. por quince minutos. 8. El sobrenadante se transfiere a otro tubo Eppendorf y se adiciona un volumen igual de la mezcla FCA. Se agita la mezcla con la ayuda de un agitador mecánico. 9. Otra vez se centrifuga la muestra a 10,000 r.p.m. a temperatura de 4 C por quince minutos. 10. El sobrenadante se traspasa a un tubo Eppendorf limpio y se agrega un volumen de mezcla CA y se agita la resultante con la ayuda de un agitador mecánico. De nuevo, se centrifuga la muestra a 10,000 r.p.m. por dos minutos. 11. El sobrenadante se traslada a un tubo Eppendorf limpio. Se adicionan dos volúmenes de etanol que este a una temperatura de -20 C y se mezclan con la ayuda de un agitador mecánico. 12. Se enfría la reacción -20 C de treinta a sesenta minutos. Transcurrido el tiempo de enfriamiento, se centrifuga la muestra a 10,000 r.p.m. a temperatura ambiente por período de quince minutos. 13. El sobrenadante se desecha y el tubo Eppendorf se coloca en posición invertida sobre una toalla de papel absorbente para que se drene todo el líquido. 14. A la pastilla resultante se le añade 1.0 ml de etanol al 70% y se agita suavemente durante dos minutos. La muestra se centrifuga a 10,000 r.p.m. durante cinco minutos. Se desecha el sobrenadante y nuevamente se seca la pastilla colocando el tubo Eppendorf en posición invertida sobre una toalla de papel absorbente. 15. La pastilla final resultante se resuspende en 0.05 ml de T. E. conteniendo Rnasa pancreático libre de DNasa. 16.

6 RESULTADOS 1. Por qué es importante crecer la cepa que contiene el plásmido en medio de cultivo con el antibiótico? 2. Qué efecto tiene el hidróxido de sodio y el SDS sobre las estructuras celulares?. 3. Porque en este método de extracción se purifica el DNA plasmídico y no el genómico? 4. Cómo cuantificaría la concentración de DNA?. Explique su respuesta.